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【摘要】  　　本研究研制新型的血小板冷凍保存液，觀察血小板在不同保存液凍存前、后的形態(tài)改變，以及體外受凝血酶作用下的活化狀態(tài)，同時(shí)比較添加UDPGal對(duì)保存液保存效果的影響。在以往單一應(yīng)用較高濃度的DMSO為血小板低溫保存液的基礎(chǔ)上，自行研制新型保存液：2% DMSO+ thrombosol+ UDPGal，在不同時(shí)間分別觀察血小板形態(tài)及測(cè)定血小板膜表面糖蛋白CD62P的表達(dá)。結(jié)果顯示，在圓形、樹(shù)突形、不規(guī)則形態(tài)的百分比方面冷凍保存對(duì)血小板形態(tài)有顯著影響，2% DMSO+ thrombosol組和2% DMSO+ thrombosol+ UDPGal組保護(hù)作用優(yōu)于5% DMSO組；與新鮮血小板相比，凍存后血小板表達(dá)CD62P明顯下降，保存1月與3月時(shí)CD62P表達(dá)無(wú)明顯差異，3種保存液組之間CD62P表達(dá)無(wú)明顯差異。結(jié)論：3種冷凍保存液中2% DMSO+ thrombosol和2% DMSO+ thrombosol+ UDPGal對(duì)血小板形態(tài)的保持效果相似，均優(yōu)于5% DMSO組。冷凍保存后血小板對(duì)凝血酶的反應(yīng)下降，3種保存液組之間無(wú)明顯差異。在保存液中添加UDPGal對(duì)保存效果沒(méi)有明顯影響。

【關(guān)鍵詞】  血小板；冷凍保存；thrombosol；UDPGal；CD62P

　　Experimental Study on Cryopreservation of Plaets

        Abstract    The study was purposed to develop a novel cryopreserved agent (CPA) for plaets, to investigate the morphology of cryopreserved plaets in different CPA and  the CD62P expression on membrane of plaets after stimulating by thrombin, as well as to compare the effect of adding UDPGal on preserved efficiency of preservation solutions. A novel cryopreserved agent consisting   of 2％ DMSO, thrombosol and UDPGal was developed on  basis of using higher concentration of DMSO. The morphology of chilled plaets was observed by transmission  electron microscope and compared with fresh plaets. The expression  of CD62P    on the membrane of plaets was detected at 0, l, 3 months. The results indicated that the significant effect of cryopreservation on morphology of plaets was found  according to  percentages of round, dendritic  and irregular shapes of cryopreserved plaets. The protective effects of 2% DMSO+thrombosol and 2% DMSO+thrombosol+UDPGal were better than that of 5% DMSO. Compared with fresh plaets, the expression of CD62P on  plaet membrane decreased obviously after cryopreservation, but not observed  difference at preservation for 1 month and 3 months, as well as among 3 kinds of different CPA. It is concluded that the protective effects of 2% DMSO+thrombosol and  2% DMSO+thrombosol+UDPGal on morphology of plaets are similar, but better than that 5% DMSO. The   reaction of cryopreserved plaets to thrombin decreases, while the significant difference is not found among these 3 kinds of CPA. The addition of UDPGal to cryopreseved agents  not show the protective effect on plaets.

    Key words    plaet; lyophilized preservation; thrombosol；UDPGal；CD62P

    隨著強(qiáng)化療和骨髓移植的迅速開(kāi)展，血小板的需求量大幅增加。然而冷凍保存后的血小板聚集功能降低，且輸注后在血循環(huán)中很快被清除［1］，極大地限制了其臨床應(yīng)用。目前廣泛使用的同種異體單采血小板僅能在22℃保存5天，且存在細(xì)菌污染及10%-20％受者發(fā)生無(wú)效輸注的問(wèn)題［2，3］。血小板保存時(shí)間短，采集成本高，約1/3血小板因過(guò)期被棄用，造成巨大浪費(fèi)。因此，如何長(zhǎng)期保存血小板成為醫(yī)學(xué)界面臨的難題。本研究采用2％ DMSO、thrombosol和UDPGal作為血小板冷凍保存劑，通過(guò)電子顯微鏡觀察冷凍前后血小板的形態(tài)變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)血小板膜表面糖蛋白CD62P的表達(dá)以反映血小板的功能，進(jìn)而比較不同保護(hù)液的作用，以期為今后的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

     材料和方法

    主要試劑

    二甲亞砜（DMSO）、thrombosol試劑購(gòu)自Sigma公司，UDP半乳糖（UDPGal）購(gòu)自Merck公司，CD62PPE單克隆抗體及PE標(biāo)記的同型單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。

    中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志  J Exp Hematol 2007; 15(2)血小板冷凍保存的實(shí)驗(yàn)研究研究對(duì)象

    健康志愿者30例，他們的血小板計(jì)數(shù)不低于180×109/L，按照全國(guó)血液質(zhì)量委員會(huì)頒布的供血者健康標(biāo)準(zhǔn)檢查合格。

    血小板的采集及冷凍保存

    用Cobe Spectra血細(xì)胞分離機(jī)（美國(guó)產(chǎn)品）采集健康人血小板30份，采集時(shí)加入枸櫞酸葡萄糖溶液1∶10抗凝，每份血小板含量約為1×1012/L。按以下方法分組保存，每組10份。A組：加5％ DMSO；B組：加2％   DMSO、thrombosol （成分為阿米洛利0.25 mmol/L、腺苷0.1  mmol/L、硝普鈉50  μmol/L）；C組：加2％  DMSO、thrombosol、UDPGal 100 μg/L。具體操作為：取30 ml血小板懸液，按組分別加入凍存劑，使其達(dá)到各組要求的終濃度，充分震蕩使血小板與凍存劑迅速混勻。每份樣本平均分為3份，1份用于立即檢測(cè)血小板，另2份置于PVC袋中，迅速用熱合儀密封，放入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谝院髾z測(cè)。

    凍存1月時(shí)血小板形態(tài)的透射電子顯微鏡觀察

    取冷凍保存1月的各組血小板，按以下方法操作：取1滴血小板懸液鋪于有Formvar膜的銅網(wǎng)上，37℃溫育8分鐘，用Tyrode氏液（137 mmol/L NaCl, 2.8 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2, 12 mmol/L NaHCO3, 10 mmol/L HEPES, 0.4 mmol/L Na2HPO4, 5.5 mmol/L Dglucose, pH 7.4）反復(fù)沖洗，自然干燥后置H600I型電子顯微鏡下觀察，每個(gè)標(biāo)本連續(xù)觀察200個(gè)血小板，計(jì)數(shù)圓形、樹(shù)突形和不規(guī)則形血小板的百分比。以未經(jīng)凍存的新鮮血小板的電子顯微鏡觀察結(jié)果為對(duì)照。

    血小板膜表面CD62P表達(dá)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)

    取未經(jīng)凍存的新鮮血小板及凍存1月、3月時(shí)的各組血小板，按以下方法操作：將2 μl血小板懸液用TB溶液（137 mmol/L NaCl, 2.8 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2, 12 mmol/L NaHCO3, 10 mmol/L HEPES, 0.4 mmol/L Na2HPO4, 0.35% BSA, 5.5 mmol/L Dglucose, pH 7.4）稀釋至濃度為（1.0-2.0）×107/L。在聚苯乙烯試管中事先加入2.5 mmol/L GPRP和0.8 μg/ml的CD62PPE單克隆抗體，分別加入30 μl稀釋血小板和終濃度為1 U/ml的牛凝血酶，37℃孵育15分鐘以確保CD62P的表達(dá)。以PE標(biāo)記的同型單克隆抗體為對(duì)照。加入等體積的1％多聚甲醛22℃固定20分鐘，再加入300 μl  TB緩沖液，用流式細(xì)胞儀585 nm波長(zhǎng)的濾過(guò)頻帶檢測(cè)PE熒光。用流式細(xì)胞儀自帶的CellQuest軟件分析結(jié)果。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVAoneway LSD分析，比較不同組間的差異。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示。

    結(jié)    果

    透射電子顯微鏡下血小板形態(tài)變化

    低倍視野下觀察顯示：新鮮血小板形態(tài)和密度較一致，多為類(lèi)圓形，內(nèi)部顆粒分布均勻，結(jié)構(gòu)清楚，部分活化的血小板可見(jiàn)有小的偽足。冷凍保存1月時(shí)的血小板形態(tài)變化較多，外形不規(guī)則，可見(jiàn)較多偽足，空泡增多，不同血小板間密度相差大，個(gè)別血小板內(nèi)部結(jié)構(gòu)消失。3種保存液凍存1月時(shí)的血小板均出現(xiàn)這些變化。高倍視野下觀察單個(gè)血小板的形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)冷凍后的血小板膜相對(duì)完整，顆粒減少且相對(duì)集中，空泡較多，糖原顆粒增加，聚集成堆，有細(xì)長(zhǎng)偽足形成。5% DMSO組個(gè)別血小板內(nèi)部結(jié)構(gòu)*消失。結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，不同凍存液保存的血小板構(gòu)成比之間的比較顯示：圓形血小板百分比在A組減少明顯，較其他組差別顯著（P<0.01）。而B(niǎo)和C組與新鮮血小板相比變化不大。3組間樹(shù)突形血小板構(gòu)成無(wú)顯著差異（P>0.05）。冷凍所致的不規(guī)則形血小板在A組較其他2組多（P<0.01），后兩者之間沒(méi)有明顯差異。可見(jiàn)冷凍對(duì)血小板形態(tài)有影響，表現(xiàn)為圓形血小板的減少和出現(xiàn)不規(guī)則形血小板，B組和C組保護(hù)作用優(yōu)于A組。

    CD62P的表達(dá)

    CD62P即P選擇蛋白存在于血小板內(nèi)α顆粒內(nèi)膜表面，當(dāng)血小板活化發(fā)生釋放反應(yīng)，CD62P在血小板膜上表達(dá)，而且分泌后不會(huì)被重新攝入，因而是反應(yīng)血小板活化的重要指標(biāo)。冷凍可導(dǎo)致血小板的活化，使其復(fù)蘇后的功能受損。當(dāng)再次受到刺激時(shí)活化率降低，影響其功能［4］。我們對(duì)不同低溫保存液冷凍保存1月和3月時(shí)的血小板，分別給予凝血酶刺激，通過(guò)檢測(cè)CD62P的表達(dá)來(lái)反應(yīng)其活性。結(jié)果見(jiàn)表2、附圖。 由表2可見(jiàn)，①未經(jīng)凍存的新鮮血小板在凝血酶刺激前、后CD62P的表達(dá)有顯著差異(P<0.001);②冷凍保存前、后（1月和3月時(shí)）的血小板在凝血酶刺激后CD62P的表達(dá)相比有顯著差異，3種保存液保存的血小板與新鮮時(shí)相比P值均<0.001。冷凍保存后的血小板（無(wú)論保存1月還是3月）在凝血酶刺激后CD62P的表達(dá)降低;③保存1月和3月時(shí)比較，各組內(nèi)無(wú)顯著差異;④保存1月時(shí)各組間比較，A對(duì)B組，P=0.187；B對(duì)C組，P=0.605；A對(duì)C組，P=0.417。這些結(jié)果說(shuō)明在冷凍保存1月時(shí)，3種不同保存液保存的血小板在凝血酶刺激后CD62P表達(dá)無(wú)顯著差異;⑤保存3月時(shí)各組間比較，A對(duì)B組，P=0.339；B對(duì)C組，P=0.222；A對(duì)C組，P=0.785，這些結(jié)果說(shuō)明在冷凍保存3月時(shí)，3種不同保存液保存的血小板在凝血酶刺激后CD62P表達(dá)也無(wú)顯著差異。
  
　　討    論

    目前5%-6%的DMSO仍為臨床常用的血小板冷凍保存劑，但使用血小板時(shí)需洗脫DMSO以減輕其毒性［5］, 這一步驟費(fèi)時(shí)費(fèi)力且需要控制冷凍的速率和特殊的設(shè)備。因此國(guó)內(nèi)對(duì)新的血小板保存方法進(jìn)行了研究［6］。

    為了解決血小板低溫下被活化而導(dǎo)致無(wú)法長(zhǎng)期保存的難題，1996年Connor等［7］研制了一種稱為thrombosol的試劑，它能與血小板內(nèi)的第二信使效應(yīng)物結(jié)合，特異地抑制血小板活化傳導(dǎo)通路。Thrombosol 由阿米洛利、腺苷、硝普鈉構(gòu)成。 阿米洛利是一種離子通道阻滯劑，通過(guò)抑制Na+/H+交換有效限制Ca2+ 內(nèi)流，從而減少血小板損傷。腺苷作用于血小板膜上特異性A2受體，活化腺苷酸環(huán)化酶，使cAMP和cGMP水平升高，減弱血小板的聚集。硝普鈉通過(guò)釋放NO來(lái)發(fā)揮其生物活性作用，NO可抑制血小板的黏附、聚集,且其抑制作用短暫而可逆。VadhanRaj等［8］以2% DMSO和thrombosol為血小板冷凍保存液，于-80℃低溫下保存，使血小板保存期延長(zhǎng)至3-6個(gè)月。

    在生理狀態(tài)下，脾臟是機(jī)體破壞清除血小板的主要場(chǎng)所,而冷凍血小板多數(shù)在肝臟內(nèi)被快速清除。血小板膜表面糖蛋白Ib（GPIb）是主要的血小板黏附受體，與血管受損處堆積的活性vWF結(jié)合，發(fā)揮黏附作用。冷凍使血小板膜上的GPIbα聚集成簇，且血小板復(fù)溫后這種構(gòu)象改變?nèi)圆豢赡妗R3在肝巨噬細(xì)胞膜上高表達(dá)，可識(shí)別聚集成簇GPIbα，介導(dǎo)肝巨噬細(xì)胞對(duì)血小板的吞噬清除。vWf、CR3與GPIbα上的不同結(jié)構(gòu)域結(jié)合。用UDP半乳糖選擇性的修飾位于GPIbα寡糖鏈N端暴露的βN乙酰氨基葡萄糖殘基，既可以阻斷CR3的識(shí)別使血小板不被肝巨噬細(xì)胞吞噬，又不影響血小板的黏附功能。血小板產(chǎn)生的半乳糖轉(zhuǎn)移酶足夠催化半乳糖化反應(yīng)，因此只需簡(jiǎn)單加入U(xiǎn)DPGal與血小板共同孵育即可使GPIbα被半乳糖化修飾。Hoffmeister等［1］用UDPGal修飾小鼠血小板GPIbα成功阻止血小板在體內(nèi)循環(huán)被快速清除。該血小板在4℃保存12天，且不影響其功能。本實(shí)驗(yàn)在低溫冷凍保存液中加入U(xiǎn)DPGal，以期解決冷凍血小板在體內(nèi)被快速清除的難題。如前所述，Hoffmeister等用UDPGal修飾小鼠冷凍血小板的實(shí)驗(yàn)是在4℃下進(jìn)行的，無(wú)需添加低溫保護(hù)劑。但是當(dāng)?shù)蜏乇Ｗo(hù)劑存在的條件下，UDPGal對(duì)其保護(hù)作用有何影響卻尚未見(jiàn)相關(guān)的報(bào)道。

    我們對(duì)不同低溫保存液冷凍保存的血小板用電子顯微鏡觀察其形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與5%　DMSO組凍存相比，用 2%　DMSO+thrombosol組和2%　DMSO+thrombosol+UDPGal組對(duì)血小板的保護(hù)作用較優(yōu)，表現(xiàn)為冷凍所致的不規(guī)則形血小板少，而正常圓形血小板的比例與新鮮血小板相比差別不大，后兩組之間沒(méi)有明顯差異。我們對(duì)不同凍存液保存后1、3月的血小板，給予凝血酶刺激，檢測(cè)CD62P的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與新鮮血小板相比凍存血小板受凝血酶刺激后表達(dá)CD62P均有明顯下降，與保存時(shí)間無(wú)明顯關(guān)系。對(duì)各保存液在1月與3月時(shí)前、后自身對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)凝血酶刺激后CD62P的表達(dá)無(wú)明顯變化，即低溫冷凍保存的時(shí)間長(zhǎng)短（至少3月內(nèi)）對(duì)血小板功能無(wú)顯著影響。保存液5%　DMSO組、2%　DMSO+ thrombosol 組和2% DMSO+ thrombosol+UDPGal組間CD62P的表達(dá)無(wú)明顯差異。

    綜上所述，本實(shí)驗(yàn)顯示2% DMSO+thrombosol及2% DMSO+thrombosol+UDPGal保存液對(duì)保持血小板形態(tài)比單用5% DMSO好，而體外功能檢測(cè)CD62P活性顯示三者無(wú)明顯差別。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在保存液中添加UDPGal對(duì)保存效果沒(méi)有影響。由于5% DMSO保存液存在毒性作用需要洗脫，且冷凍保存時(shí)需控制降溫速度等缺點(diǎn)，與之相比2% DMSO+thrombosol保存液具有明顯優(yōu)勢(shì)。而對(duì)冷凍血小板進(jìn)行半乳糖化修飾更是可以解決冷凍血小板在輸注后體內(nèi)快速被清除的難題，使其臨床應(yīng)用不再受限。

【參考文獻(xiàn)】
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3Hogge DE, McConnell M, Jacobson C, et al. Plaet refractoriness and alloimmunization in pediatric oncology and bone marrow transplant patients. Transfusion, 1995; 35: 645-652

4Currie LM, Lichtiger B, Livesey SA, et al. Enhanced circulatory parameters of human plaets cryopreserved with secondmessenger effectors: an in vivo study of 16 volunteer plaet donors. Br J Haematol, 1999; 105: 826-831

5Bock M, Schleuning M, Heim MU, et al. Cryopreservation of human plaets with dimethyl sulfoxide: changes in biochemistry and cell function. Transfusion, 1995; 35: 921-924

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7Connor J, Currie LM, Allan H, et al. Recovery of in vitro functional activity of plaet concentrates stored at 4 degree C and treated with second messenger effectors. Transfusion, 1996; 36: 691-698

8VadhanRaj S, Kavanagh JJ, Freedman RS, et al. Safety and efficacy of transfusions of autologous cryopreserved plaets derived from recombinant human thrombopoietin to support chemotherapyassociated severe thrombocytopenia: a randomised crossover study. Lancet, 2002; 359(9324): 2145-2152